中学生彼特·帕克（托比·马奎尔饰）自幼父母双亡，与心爱的舅舅、舅妈一起生活在纽约皇后区，过着一个普通学生的生活。就像来自美国许多破碎家庭的孩子一样，尽管彼得人很聪明却很害羞，因此，常常受到一些同学的嘲弄，除了比他更懦弱的哈里·奥斯伯恩（詹姆斯·弗兰科饰），彼特没有任何朋友，不过彼得一直对邻居家的女孩玛丽（克尔斯滕·邓斯特饰）情有独钟。但哈里·奥斯本也同他一样爱上了玛丽。

在一次学校组织的活动中，彼得和同学们去看有关蜘蛛的科学展览。正在拍照的彼得没有注意一只基因变异的蜘蛛从大棚的吊灯上顺着蛛丝猛然掉落，慌不择路间在彼得的手上咬了一口，彼得的手马上肿了起来。

回家之后彼得在发了一夜的高烧后，突然发现自己竟被神奇地赋予了蜘蛛的那种能够感知危险来临的第六感，还拥有了许多非同寻常的能力：他成了一只力量超凡、身手敏捷、可以飞岩走壁、发网状粘液的“蜘蛛人”。

像所有传说中的英雄人物一样，彼得为自己设计了一套红色蜘蛛紧身服和面具。不久他出现在电视转播的摔跤比赛场上，用自己神奇的力量打败了强悍的对手。但摔跤比赛的主办人拒绝发给彼得3000美元的奖金，理由是他赢得太快了，彼得因此怀恨在心。

没想到天赐良机，彼得正好撞上从那个主办人办公室里逃出来的窃贼，为报复主办人他放过了窃贼。由于彼得的自私，他因此付出了沉重的代价——正是这个窃贼杀害了他亲爱的舅舅。作为蜘蛛侠，彼得给了那个窃贼应有的惩罚，但他深受悔恨的折磨。

他恨自己没有早日行侠仗义，并在悔恨中想起了舅舅跟他说过的一句话：“能力越大，那你的责任也就越大”。彼得将这句话铭记在心，他决定献身于与罪恶的斗争之中。从此，在城市的每一个角落，只要有犯罪行为，蜘蛛侠就会从天而降，协助警方把罪犯绳之以法。